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质粒DNA提取不管小提大提都离不开它

发布时间:2020-12-9 17:48:12      点击:

  离心机在质粒DNA提取中有着很重要的地位,而且操作流程复杂。

  因为质粒DNA作为基因重组与基因转移的载体,在遗传工程研究中很重要。

626969com澳门资料大全-澳门六和合开奖结果直播-澳门天天六彩资料  所以在日常的细胞实验中经常会用到质粒DNA,现在都用剂盒非常方便,而且菌体培养后,可以多管浓缩提取,提到的质粒量多,可以-20℃保存,以后用于酶切、转化等实验,可以提前跑个胶,只要不降解,就可以继续用,避免每次要用,都要培养一遍再提取一遍。

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  质粒DNA常见的提取方式分为两种:

  一.质粒小提

626969com澳门资料大全-澳门六和合开奖结果直播-澳门天天六彩资料  将之前准备的LB液体培养基中加入抗性(氨苄1:1000),取15ml 离心管,加入5ml 已加入抗性的液体培养基。

626969com澳门资料大全-澳门六和合开奖结果直播-澳门天天六彩资料  用小白Tips从平板中挑选单克隆,将小枪头打入15ml 离心管中,30℃,180rpm,摇 >5h,以看到液体培养基变浑浊为准。

626969com澳门资料大全-澳门六和合开奖结果直播-澳门天天六彩资料  取干净的1.5ml EP管,从15ml 离心管中吸取1.5ml(这个量可根据菌液混浊程度加减)菌液,离心机12000rpm,离心3min。

  弃上清,加入250ul TIANGEN质粒小提Kits(Cat# DP103-03,Lot# 6123)P1液,震荡,彻底混匀。

  加入250ul P2液,温和(以免DNA断裂)翻转6-8次,使菌体充分裂解。(这一步总时间不要超过5min,防止过度裂解,质粒受到破坏)

626969com澳门资料大全-澳门六和合开奖结果直播-澳门天天六彩资料  向EP管中加入350ul P3液,立即温和上下翻转6-8次,充分混匀,此时可看到白色絮状沉淀,离心机12000rpm,离心3min。(P3加入后应立即混匀,避免产生局部沉淀,若上清中还有微小白色沉淀,可再次离心后取上清)

  将吸附柱CP3(实验前用平衡液BL处理吸附柱可最大限度激活硅基质膜,提高得率;BL处理过的吸附柱最好当天使用,放置时间过长会影响效果)放在收集管中,将上清转移到吸附柱CP3中,尽量不要吸到沉淀,离心机12000rpm,离心30-60s,倒掉收集管中的废液,将吸附柱放入收集管。

  可选步骤:向CP3中加入500ul去蛋白液PD,12000rpm,离心30-60s,倒掉收集管中的废液,将吸附柱放入收集管。(如果宿主菌是end A+ 宿主菌TG1、BL21、HB101、JM系列、ET12567等,因其含有大量核酸酶,所以推荐此步骤;若为end A- 宿主菌DH5α、TOP10等,可省略此步)

  向CP3中加入600ul 漂洗液PW(已加入无水乙醇),12000rpm,离心30-60s,倒掉收集管中的废液,将吸附柱放入收集管。

  重复步骤9。

  离心机12000rpm,离心2min,目的是将吸附柱中残余的漂洗液去掉。

  将CP3吸附柱放入一个干净的1.5ml EP管中,向吸附膜的中间部位滴加50-100ul洗脱液EB,室温放置2min,12000rpm,离心2min,将质粒溶液收集到EP管中。(为增加质粒得率,可将溶液再次加入吸附柱CP3,室温放置2min,12000rpm,离心2min,将质粒溶液收集到EP管中;也可以提前65-70℃预热EB液)

  测浓度,跑胶看提取质粒的质量。

  二.质粒大提,操作这一步前一般要质粒小提确认质粒的质量。

626969com澳门资料大全-澳门六和合开奖结果直播-澳门天天六彩资料  取洁净的锥形瓶,加入小提步骤1中的LB液体培养基100ml,取小提步骤2中的菌液10ul 加入锥形瓶中,30℃,180rpm,摇过夜,以看到液体培养基变浑浊为准。

  保存菌种:用15%的甘油保存菌种:1.5ml EP管中加入350ul 菌液+150ul 50%甘,混匀,-80℃保存。

  将锥形瓶中剩下的菌液用50ml 离心管,4℃,8000rpm,离心5min,收集菌体沉淀,可同管多次。

  根据所选大提试剂盒的说明书按步骤提取,不同试剂盒步骤不一样。

  提取结束后测浓度,跑胶(因质粒分子量一般较大,所以用低浓度的琼脂糖胶和大的marker)

  以上就是关于离心机在质粒DNA提取中的应用总结,如果您还想了解更多有关产品的应用信息,可多多关注上海卢湘仪离心机仪器有限公司。


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