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如何利用离心机提取乳酸脱氢酶及辅酶

发布时间:2021-2-23 15:37:53      点击:

  先来了解下概念以及作用,提取过程不易,总要明确提取目的。

626969com澳门资料大全-澳门六和合开奖结果直播-澳门天天六彩资料  乳酸脱氢酶及辅酶概念:

626969com澳门资料大全-澳门六和合开奖结果直播-澳门天天六彩资料  乳酸脱氢酶(LDH或LD)是糖无氧酵解及糖异生的重要酶系之一,可催化丙酮酸与L-乳酸之间的还原与氧化反应,也可催化相关的α-酮酸。LDH广泛存在于人体组织中,以心、肾、骨骼肌含量最高,肝、脾、胰和肺组织次之。LDH测定方法主要有比色法和连续监测法。

  辅酶(coenzyme)是一类可以将化学基团从一个酶转移到另一个酶上的有机小分子,与酶较为松散地结合,对于特定酶的活性发挥是必要的。有许多维他命及其衍生物,如核黄素、硫胺素和叶酸,都属于辅酶。这些化合物无法由人体合成,必须通过饮食补充。

  乳酸脱氢酶及辅酶作用:

  乳酸脱氢酶由酶蛋白和辅酶Ⅰ组成,两者单独存在时,无催化活性,必须共同存在组成全酶才起作用。乳酸脱氢酶广泛存在于各种组织细胞,在代谢过程中有重要意义,它可逆地催化乳酸脱氢形成丙酮酸或丙酮酸接受氢生成乳酸,反应中由辅酶Ⅰ(NAD+)起传递氢的作用。乳酸脱氢酶属于不需氧脱氢酶,不能直接将氢交给氧,反应中生成的还原型辅酶I,可与其他酶蛋白结合,将氢传给其他的递氢体,通过呼吸链被彻底氧化。

626969com澳门资料大全-澳门六和合开奖结果直播-澳门天天六彩资料  利用离心机提取乳酸脱氢酶及辅酶得方法:

  本实验以乳酸为底物。用新鲜的动物肝脏或肌肉组织的粗制提取液,分别制成酶蛋白部分(用白陶土吸附除去辅酶Ⅰ)和辅酶部分(加热破坏酶蛋白),观察两者单独作用及共同作用的情况。实验中为了便于观察,用甲烯兰(美兰)作为受氢体,已知甲烯兰能从还原型黄酶接受氢而由蓝色变成白色(甲烯白)。所以本实验中根据溶液蓝色的消褪情况判断乳酸脱氢反应的发生。

  实验器材

626969com澳门资料大全-澳门六和合开奖结果直播-澳门天天六彩资料  水浴锅;离心机;离心管;试管;研钵;剪刀;镊子;实验动物(小鼠、大鼠或兔)。

  实验试剂

626969com澳门资料大全-澳门六和合开奖结果直播-澳门天天六彩资料  1.玻璃砂 充分洗净。

  2.0.1MpH7.4磷酸缓冲液 称取Na2HPO411.92g,KH2PO42.18g,加水定容至1升。

  3.白陶土 用于吸附辅酶Ⅰ。

  4.0.5%KCN液 称取KCN 0.5g,加水溶解成100ml。

626969com澳门资料大全-澳门六和合开奖结果直播-澳门天天六彩资料  5.5%乳酸钠溶液 称取乳酸钠5g,加水溶解成100ml。

  6.0.04%甲烯兰液 称取甲烯兰0.04g,加水溶解成100ml。

  实验方法

626969com澳门资料大全-澳门六和合开奖结果直播-澳门天天六彩资料  1.分别制备酶蛋白提取液及辅酶Ⅰ提取液

  (1)除去辅酶Ⅰ的酶蛋白提取液:取新鲜动物肝(或肌肉)组织3g,剪碎放研钵中加玻璃砂约0.5g,白陶土0.5g,加pH 7.4 0.1M磷酸缓冲液8ml,研成细粥状。移入离心管中,以2000rpm离心机离心5min,倾于另一试管中备用。

  (2)辅酶Ⅰ提取液:取蒸馏水10ml于中试管中,加热煮沸。取新鲜的肝(或肌肉)组织3g,剪碎,放入沸水中,继续煮沸10min,为防止水分过多蒸发可加盖。稍冷后倾入乳钵中研细,移入离心管中放入离心机离心10min,取上清液备用。

626969com澳门资料大全-澳门六和合开奖结果直播-澳门天天六彩资料  2.取试管4只,标明管号,按下图表加样:

  3.充分混匀,向各管徐徐加人液体石蜡5滴(避免与空气接触),静置试管架上或放37℃水浴15~30min,随时观察并记录各管褪色情况,分析结果。

  注意事项:

626969com澳门资料大全-澳门六和合开奖结果直播-澳门天天六彩资料  1.KCN剧毒,注意安全。

626969com澳门资料大全-澳门六和合开奖结果直播-澳门天天六彩资料  2.乳酸脱氢生成的丙酮酸与KCN结合,防止可逆反应发生。

626969com澳门资料大全-澳门六和合开奖结果直播-澳门天天六彩资料  3.本实验中生成的甲烯白易被空气氧化又转变成甲烯兰,所以在加入液体石蜡后观察褪色时不宜振荡。

  4.  离心机626969com澳门资料大全-澳门六和合开奖结果直播-澳门天天六彩资料选择合适转数,使用注意安全。


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